1556年1月16日，他将西班牙及其在美洲的西班牙帝国交给了菲利普。

1556年8月27日，他将神圣罗马帝国皇帝的位子让给了他的弟弟斐迪南，斐迪南于1531年被选为罗马国王。

皇帝的继承在1558年时被法兰克福集会的选侯们认可，1559年时被教皇认可。

皇帝的退位还标志着斐迪南在奥地利领土上的法律和实质统治的开始，自1521-1522年起他便以查理的名义治理这些领土，并自1526年起附属于匈牙利和波希米亚。

据学者分析，查理决定退位的原因多种多样：

1555年确认的德国宗教分裂；

西班牙财政状况的恶化，在他统治结束时已经因通货膨胀而破产；

意大利战争的复苏，法国国王亨利二世的攻击；

奥斯曼帝国在地中海和中欧的不断进逼；

以及他健康状况的恶化，尤其是痛风的发作，比如迫使他推迟重新夺回梅斯城的企图，而他最终在该地战败。

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查理之死。

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1556年9月，查理离开低地国家，和他的姐妹玛丽·匈牙利和埃莉诺·奥地利一起乘船前往西班牙。

他于1557年抵达极端地区的尤斯特修道院。

他继续广泛通信，并对帝国的局势保持关注，同时饱受严重的痛风折磨。

他独自生活在一个隐蔽的修道院里，四周环绕着提香的画作，墙上挂满了钟表，许多历史学家认为这些钟表象征着他的统治和他缺乏时间。

1558年8月，查理病重，后来在21世纪被揭示为患上了疟疾。

他于1558年9月21日凌晨去世，享年58岁，手中握着他妻子伊莎贝拉去世时所握的十字架。

查理去世后，他的帝国内举行了大量的纪念活动，包括在墨西哥和秘鲁。